আণবিক নির্ণয়, সাধারণত ব্যবহৃত পিসিআর প্রযুক্তি এবং নীতি

পিসিআর, হল পলিমারেজ চেইন বিক্রিয়া, যা ডিএনএ পলিমারেজের অনুঘটকের অধীনে সিস্টেমে dNTP, Mg2+, প্রসারণ কারণ এবং পরিবর্ধন বর্ধনের কারণগুলির সংযোজন বোঝায়, প্যারেন্ট ডিএনএকে একটি টেমপ্লেট হিসাবে এবং নির্দিষ্ট প্রাইমারগুলিকে এক্সটেনশনের সূচনা বিন্দু হিসাবে ব্যবহার করে, ডিনাচুরেশন, অ্যানিলিং, এক্সটেনশন ইত্যাদি ধাপের মাধ্যমে, ইন ভিট্রো রেপ্লিকেটিং কন্যা স্ট্র্যান্ড ডিএনএ প্যারেন্ট স্ট্র্যান্ড টেমপ্লেট ডিএনএর পরিপূরক প্রক্রিয়া দ্রুত এবং বিশেষভাবে ভিট্রোতে যেকোনো লক্ষ্য ডিএনএকে প্রসারিত করতে পারে।

1. হট স্টার্ট পিসিআর

প্রচলিত পিসিআর-এ পরিবর্ধনের শুরুর সময় হল পিসিআর মেশিনকে পিসিআর মেশিনে রাখা নয়, এবং তারপরে প্রোগ্রামটি প্রসারিত হতে শুরু করে।সিস্টেম কনফিগারেশন সম্পন্ন হলে, পরিবর্ধন শুরু হয়, যা অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের কারণ হতে পারে এবং হট-স্টার্ট পিসিআর এই সমস্যার সমাধান করতে পারে।

হট স্টার্ট পিসিআর কি?প্রতিক্রিয়া সিস্টেম প্রস্তুত হওয়ার পরে, প্রতিক্রিয়ার প্রাথমিক উত্তাপের পর্যায়ে বা "হট স্টার্ট" পর্যায়ে উচ্চ তাপমাত্রায় (সাধারণত 90 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেডের বেশি) এনজাইম সংশোধক মুক্তি পায়, যাতে ডিএনএ পলিমারেজ সক্রিয় হয়।সঠিক সক্রিয়করণের সময় এবং তাপমাত্রা ডিএনএ পলিমারেজ এবং হট-স্টার্ট মডিফায়ারের প্রকৃতির উপর নির্ভর করে।এই পদ্ধতিটি মূলত ডিএনএ পলিমারেজের কার্যকলাপকে বাধা দেওয়ার জন্য অ্যান্টিবডি, অ্যাফিনিটি লিগ্যান্ড বা রাসায়নিক সংশোধকগুলির মতো সংশোধক ব্যবহার করে।যেহেতু ডিএনএ পলিমারেজের ক্রিয়াকলাপ ঘরের তাপমাত্রায় বাধাগ্রস্ত হয়, তাই হট স্টার্ট প্রযুক্তি পিসিআর প্রতিক্রিয়াগুলির নির্দিষ্টতাকে ত্যাগ না করে ঘরের তাপমাত্রায় একাধিক পিসিআর প্রতিক্রিয়া সিস্টেম প্রস্তুত করার জন্য দুর্দান্ত সুবিধা প্রদান করে।

2. RT-PCR

RT-PCR (রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন পিসিআর) হল mRNA থেকে cDNA-তে বিপরীত প্রতিলিপির জন্য একটি পরীক্ষামূলক কৌশল এবং এটিকে পরিবর্ধনের জন্য একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহার করা।পরীক্ষামূলক পদ্ধতি হল প্রথমে টিস্যু বা কোষে মোট RNA বের করা, প্রাইমার হিসাবে Oligo (dT) ব্যবহার করা, cDNA সংশ্লেষিত করতে বিপরীত ট্রান্সক্রিপ্ট ব্যবহার করা এবং তারপর লক্ষ্য জিন পেতে বা জিনের অভিব্যক্তি সনাক্ত করতে PCR পরিবর্ধনের জন্য একটি টেমপ্লেট হিসাবে cDNA ব্যবহার করা।

3. ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর

ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর (রিয়েল-টাইম পরিমাণগত পিসিআর,RT-qPCR) পিসিআর প্রতিক্রিয়া সিস্টেমে ফ্লুরোসেন্ট গ্রুপ যোগ করার পদ্ধতিকে বোঝায়, বাস্তব সময়ে সমগ্র পিসিআর প্রক্রিয়া নিরীক্ষণের জন্য ফ্লুরোসেন্ট সংকেতগুলির জমাকরণ ব্যবহার করে এবং পরিশেষে টেমপ্লেটটি পরিমাণগতভাবে বিশ্লেষণ করতে স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখা ব্যবহার করে।সাধারণত ব্যবহৃত qPCR পদ্ধতিগুলির মধ্যে SYBR Green I এবং TaqMan অন্তর্ভুক্ত।

4. নেস্টেড পিসিআর

নেস্টেড পিসিআর বলতে দুটি রাউন্ড পিসিআর অ্যামপ্লিফিকেশনের জন্য পিসিআর প্রাইমারের দুটি সেটের ব্যবহার বোঝায় এবং দ্বিতীয় রাউন্ডের পরিবর্ধন পণ্যটি লক্ষ্য জিন খণ্ড।

যদি প্রথম জোড়া প্রাইমারের (বাহ্যিক প্রাইমার) অমিলের কারণে একটি অ-নির্দিষ্ট পণ্যকে বিবর্ধিত করা হয়, তবে একই অ-নির্দিষ্ট অঞ্চলের দ্বিতীয় জোড়া প্রাইমার দ্বারা স্বীকৃত হওয়ার এবং প্রশস্তকরণ অব্যাহত রাখার সম্ভাবনা খুবই কম, তাই প্রাইমারের দ্বিতীয় জোড়া দ্বারা পরিবর্ধন, পিসিআর-এর নির্দিষ্টতা উন্নত করা হয়েছে।দুই রাউন্ড পিসিআর করার একটি সুবিধা হল এটি সীমিত প্রারম্ভিক ডিএনএ থেকে পর্যাপ্ত পণ্যকে প্রসারিত করতে সাহায্য করে।

5. টাচডাউন পিসিআর

টাচডাউন পিসিআর হল পিসিআর চক্রের পরামিতি সামঞ্জস্য করে পিসিআর প্রতিক্রিয়ার নির্দিষ্টতা উন্নত করার একটি পদ্ধতি।

টাচডাউন পিসিআর-এ, প্রথম কয়েকটি চক্রের জন্য অ্যানিলিং তাপমাত্রা প্রাইমারগুলির সর্বাধিক অ্যানিলিং তাপমাত্রা (Tm) থেকে কয়েক ডিগ্রি উপরে সেট করা হয়।উচ্চ অ্যানিলিং তাপমাত্রা কার্যকরভাবে অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন হ্রাস করতে পারে, কিন্তু একই সময়ে, উচ্চ অ্যানিলিং তাপমাত্রা প্রাইমার এবং লক্ষ্য ক্রমগুলির পৃথকীকরণকে বাড়িয়ে তুলবে, যার ফলে পিসিআর ফলন হ্রাস পাবে।অতএব, প্রথম কয়েকটি চক্রে, সিস্টেমে লক্ষ্য জিনের বিষয়বস্তু বাড়ানোর জন্য অ্যানিলিং তাপমাত্রা সাধারণত প্রতি চক্রে 1°C কমতে সেট করা হয়।যখন অ্যানিলিং তাপমাত্রা সর্বোত্তম তাপমাত্রায় নামিয়ে আনা হয়, তখন বাকি চক্রের জন্য অ্যানিলিং তাপমাত্রা বজায় রাখা হয়।

6. সরাসরি পিসিআর

ডাইরেক্ট পিসিআর বলতে নিউক্লিক অ্যাসিড বিচ্ছিন্নতা এবং বিশুদ্ধকরণের প্রয়োজন ছাড়াই সরাসরি নমুনা থেকে লক্ষ্য ডিএনএর পরিবর্ধনকে বোঝায়।

দুটি ধরণের সরাসরি পিসিআর রয়েছে:

সরাসরি পদ্ধতি: অল্প পরিমাণ নমুনা নিন এবং পিসিআর সনাক্তকরণের জন্য সরাসরি পিসিআর মাস্টার মিক্সে যোগ করুন;

ক্র্যাকিং পদ্ধতি: নমুনা নমুনা করার পরে, এটি লাইসেটে যোগ করুন, জিনোম প্রকাশ করতে লাইস করুন, অল্প পরিমাণে লাইজড সুপারনাট্যান্ট নিন এবং এটি পিসিআর মাস্টার মিক্সে যোগ করুন, পিসিআর সনাক্তকরণ সম্পাদন করুন।এই পদ্ধতিটি পরীক্ষামূলক কর্মপ্রবাহকে সহজ করে, হাতে সময় কমায় এবং পরিশোধন পদক্ষেপের সময় ডিএনএ ক্ষতি এড়ায়।

7. SOE PCR

ওভারল্যাপ এক্সটেনশন পিসিআর (এসওই পিসিআর) দ্বারা জিন স্প্লিসিং পিসিআর পণ্যগুলিকে ওভারল্যাপিং চেইন তৈরি করতে পরিপূরক প্রান্ত সহ প্রাইমার ব্যবহার করে, যাতে পরবর্তী পরিবর্ধন প্রতিক্রিয়াতে, ওভারল্যাপিং চেইনগুলির এক্সটেনশনের মাধ্যমে, একটি কৌশলের বিভিন্ন উত্স যেখানে পরিবর্ধিত টুকরোগুলি ওভারল্যাপ করা হয়। এবং একসাথে বিভক্ত।এই প্রযুক্তির বর্তমানে দুটি প্রধান প্রয়োগের দিক রয়েছে: ফিউশন জিন নির্মাণ;জিন সাইট-নির্দেশিত মিউটেশন।

8. আইপিসিআর

ইনভার্স পিসিআর (আইপিসিআর) দুটি প্রাইমার ব্যতীত অন্য ডিএনএ খণ্ডকে প্রশস্ত করতে বিপরীত পরিপূরক প্রাইমার ব্যবহার করে এবং একটি পরিচিত ডিএনএ খণ্ডের উভয় পাশে অজানা ক্রমগুলিকে প্রশস্ত করে।

আইপিসিআর মূলত সংলগ্ন অজানা অঞ্চলের ক্রম নির্ধারণের জন্য ডিজাইন করা হয়েছিল এবং এটি বেশিরভাগ জিন প্রবর্তক ক্রম অধ্যয়ন করতে ব্যবহৃত হয়;অনকোজেনিক ক্রোমোসোমাল পুনর্বিন্যাস, যেমন জিন ফিউশন, স্থানান্তর এবং স্থানান্তর;এবং ভাইরাল জিন ইন্টিগ্রেশন, এখন সাধারণত ব্যবহৃত হয় সাইট-নির্দেশিত মিউটাজেনেসিসের জন্য, পছন্দসই মিউটেশন সহ একটি প্লাজমিড অনুলিপি করুন।

9. dPCR

ডিজিটাল পিসিআর (ডিপিসিআর) হল নিউক্লিক অ্যাসিড অণুর পরম পরিমাণ নির্ধারণের একটি কৌশল।

নিউক্লিক অ্যাসিড অণুর পরিমাণ নির্ধারণের জন্য বর্তমানে তিনটি পদ্ধতি রয়েছে।ফটোমেট্রি নিউক্লিক অ্যাসিড অণুর শোষণের উপর ভিত্তি করে;রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্ট কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর (রিয়েল টাইম পিসিআর) Ct মানের উপর ভিত্তি করে, এবং Ct মানটি সনাক্ত করা যেতে পারে এমন ফ্লুরোসেন্স মানের সাথে সম্পর্কিত চক্র সংখ্যাকে বোঝায়;ডিজিটাল পিসিআর হল নিউক্লিক অ্যাসিডের পরিমাণ গণনা করার জন্য একক-অণু পিসিআর পদ্ধতির উপর ভিত্তি করে সর্বশেষ পরিমাণগত প্রযুক্তি যা একটি পরম পরিমাণগত পদ্ধতি।